基因敲除稳转细胞株

1、技术原理：

CRISPR/Cas9系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracr-RNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，该复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（shortguideRNA），以引导Cas9对DNA特点位点的切割。

Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域，NHN（切割与crRNA互补的链）和RuvC（切割非互补链），可以分别切割DNA两条单链，造成DNA双链断裂，触发细胞紧急修复。DNA双链断裂的修复，包括同源介导的修复（Homology Directed Repair, HDR）和非同源末端连接（Non homologous End Joining，NHEJ）两种。

当细胞采取NHEJ的方式进行修复时，极易出现错误，导致碱基的缺失或插入，致使目的基因移码失活，达到基因敲除的目的。

2、技术优势：

① 我们采用质粒电转法构建敲除细胞稳转株，利用多条gRNA同时电转，可实现更大片段的敲除，使靶基因功能丢失，敲除更彻底。

② 质粒电转法属于瞬时表达，随后质粒在细胞内被降解，与慢病毒法相比，无病毒骨架的随机整合，风险大大降低。

③ 我们可额外提供敲除后验证服务，如QPCR、Western Blot等，为客户提供更优质更全面的服务。

④ 实验前进行严格的预实验（包括验证细胞单克隆形成率，最佳电转效率条件摸索，细胞最小全致死浓度，靶位点附近序列验证等），提高项目一次通过率，大大缩短实验周期。

3、质量控制：
敲除载体经过酶切、菌落PCR和测序验证；电转前质粒浓度必须大于1ug/ul；敲除阳性克隆经过PCR和测序验证，对于两个亲本敲除情况不一致的细胞，会进行TA克隆验证，严格把控生产过程每个环节。

4、应用：
研究基因/蛋白的功能；模拟人类疾病进行药物研究和筛选；靶点验证等。